如何选出最优的细胞计数方案

   细胞计数：我们中的许多人每天很多次的检测，大多数是基于细胞为基础，但细胞计数，或者更准确地说，“准确的细胞计数”可能非常困难。BIOFOUNT公司 带您探讨不同的细胞计数方法、它们的用途以及各种细胞计数方法的局限性，帮助大家选择出适合您实验室需求的细胞计数方法。

细胞计数和活力测定对于几乎所有的临床和转化研究应用都至关重要，然而，在细胞计数过程中存在许多陷阱，这可能会对测定性能产生深远的影响。为了解决这些问题，过去十年中，细胞计数领域取得了很大的进展，使细胞计数这一传统过程变的高度自动化和智能化。

一、细胞计数（血球法）

细胞计数计数虽然在进步，血球细胞计数法仍然是许多实验室进行细胞研究的黄金标准。血球计数法是由Louis-Charles Malassez发明的，用于血细胞计数，这种方法可以用于不同样本类型中的细胞计数，包括血液、细胞培养物、尿液和水样等。在将样品加载到血球计数板上之前，可以使用活性染料如：台盼蓝来区分活细胞和死细胞。

其核心，血球计数板是一种上部需要配载玻片的100um腔体，其主要特征是：网格，在一个9平方毫米的区间，勾勒出一个1毫米x 1毫米的区域，将每个正方形相交成横截面，形成0.00025平方毫米的最小细分单元。当用盖玻片覆盖时，可以形成了一个0.1毫米高的腔室，因此在这个空腔内就可以产生了一个已知体积的空间。

         通常我们使用4倍或10倍物镜对四个角1mm x 1mm正方形中的每一个区内的细胞进行计数，并计算出平均值。细胞数量等于=平均细胞数x 10的四次方 x稀释因子

为了细胞计数统计的稳定性，每平方毫米建议100-200个细胞。有时候细胞密度不够高，无法达到这一密度，其他情况下，我们可能需要对细胞浓度进行稀释，这是稀释因子可能至关重要。

使用血球计数法进行细胞计数的准确性，会受到许多因素的影响，主要是我们在混合、移液和处理过程中的各种可变性，以及实验室之间仪器以及材料的差异造成的。其中：稀释因子之间的不确定性带来误差可能>55%，根据以往细胞计数统计，实验员之间的变化带来细胞计数结果差别高达52%（Freund和Carol，1964）。为了克服细胞计数过程中这些高变异系数，一般建议同一样本需要多次计数。实际试验中，尤其在高通量的实验室中，该方法难以执行？

为了解决血球计细胞计数法中的一些局限性，BIOFOUNT公司（细胞计数类产品公司） 提出了一些简单实用的方法，可以帮助血球细胞计数法的统计精度：

1. 在采集样本和等分多个样本之前，需对样本进行彻底混合和摇匀，可以提高统计显著性和细胞计数的稳定性；

2. 在细胞计数之前，在使用细胞样品前，采取过滤来减少样品内的团块；

3. 当使用活性染料时，重点是：在细胞计数之前不要等待太久；台盼蓝是一种常见的死细胞染料，如果细胞接触这种有毒染料超过10分钟，可能会使死细胞或活细胞都被染色。因此，请确保染色和计数的效率。或者使用不可渗透细胞膜的DNA染料，如（DAPI），它只会被死细胞吸收；

4. 移液器的校准——对于细胞计数实验室来说，移液器的维护和校准也至关重要；

5. 对连续稀释样品进行分析，如：擦拭移液吸头尖端外表面的多余液滴；

6. 正确的放置盖玻片并将样品加载到细胞计数板上，以确保细胞计数板腔体内没有气泡。另一个需要考虑的因素是：较大的细胞可能集中在腔体的边缘，这可能会影响需要统计的细胞数量。

7. 用酒精清洗对盖玻片和血球板进行清洗，以确保碎屑清除，也需确保整个腔体内细胞均匀分布。由于细胞悬浮液样品通过虹吸作用进入腔体，任何碎屑或气穴都可能破坏细胞进入腔体这一过程。

8. 标准化操作流程--由于血球计数法是一个手动的细胞计数过程，没有规范化的计数方法可能会影响细胞计数的重复精确性；标准化则尤为重要。

二、细胞计数仪选择时的注意事项

由于人工细胞计数涉及如此多的因素和存在主观性，因此，许多自动细胞计数仪在商业上获得成功并不足为奇，细胞计数仪克服了观察者间的差异性和血球计数板细胞分布相关的诸多问题。随着细胞计数仪技术的不断发展，为手动细胞计数提供了一种高效的替代方案。然而，每个细胞计数仪都有优缺点，因此了解和考虑特定实验室需求并选择出需要的细胞计数仪尤为重要。

自动细胞计数仪通常分为四种类型：阻抗（库尔特原理）、光学（光散射）；流式细胞术和使用特殊染色的直接成像计数仪。每个平台都有独特的应用场景和优势，因此研了解每种细胞计数原理和功能，并确保所采用的仪器符合实验室的需求是很重要的。

三、细胞计数仪的工作原理？

1. 阻抗法细胞计数仪的工作原理是：当细胞通过孔径时，通过电阻抗的变化对单元进行计数和调整大小。阻抗法是最早的自动化细胞计数仪的典型技术之一，在许多医院和实验室中仍然很常见。

2. 光学法细胞计数仪使用由光电探测器探测细胞和对细胞进行统计。该方法在性质上与流式细胞仪非常相似，例如：基于简单的散点图来区分各种细胞类型。

3. 流式细胞术仪利用前向散射来识别细胞及其大小和体积，并结合侧散射来提供关于细胞内部复杂性的信息。侧荧光也可用于测量细胞内的RNA和DNA含量。例如：也有制造出手持流式细胞仪，以支持非洲的艾滋病毒检测和监测。许多现有技术的无染色细胞计数平台都利用专有算法使用透射光特征来描述从CHO和HeLa到THP-1和胚胎干细胞的许多常用细胞类型。基于库尔特和流式细胞仪的细胞计数设备可以广泛的用于各种样品和细胞类型。它们在不结块的细胞样本上表现最好，这可能会导致巧合，从而误读细胞数量。Coulter和流式细胞仪细胞计数方法的一个主要优点是：它们兼容的细胞类型更为广泛。包括：细胞培养和原代细胞、PBMC、酵母和细菌，但需要仪器或门控调整来识别感兴趣的样本群体。

4. 细胞成像计数：近几年成像细胞计数仪得到了快速发展。成像计数仪依赖于自动聚焦和曝光技术，再加上机器的算法，对广泛的细胞类型样本、细胞大小和细胞密度范围可以提供精确的统计。当涉及到高度异源或具有更高聚集倾向的细胞样本时，成像类的细胞计数仪可能具有更高的价值，因为该系统能够容易地破译细胞团块之间的边界并识别碎片、死亡/垂死细胞以及各种大小的细胞。

成像技术中的许多仪器采用了基于荧光的细胞计数方法，其提供了优于台盼蓝的区分碎片的能力的解决方案。吖啶橙（AO）和碘化丙啶（PI）的最佳组合之一被许多细胞计数平台所使用。AO是膜可渗透的，可以染色活细胞的细胞核DNA，而PI只染色死细胞。来自这些染料中的每一种的荧光信号都很容易分辨，有核颗粒的阳性染色有助于支持准确的细胞活力测定。这对于PBMC计数特别有用，因为RBCs基于其缺乏PI染色而易于区分。

四、选择细胞计数仪需要考虑的关键指标

1. 细胞计数的效率，不同细胞计数仪的技术效率千差万别，根据自己样本量选择匹配技术效率的细胞计数仪；

2. 分析的样本类型--根据样本单元大小和复杂性的异质性选择所需的仪器。

3. 最佳精度与样品量——同一仪器中同时实现效率和精度两个目标好像难以实现。根据您的实验要求，精确的细胞计数是否至关重要，或者+/-20%偏差就足够了？

4. 监管合规性——因此审计试验是我们的一个重要考虑因素-您的实验室是否需要相关认证？

5. 染色注意事项：是否需要有核细胞染色与无核细胞染色？

6. 便捷性--实验室需要台式机还是手持式细胞计数仪？

7. 所细胞计数动态范围--目前主流的计数仪基本都可以准确统计出细胞密度低至1×10⁴个细胞/每毫升到1 x 10⁷个细胞/每毫升的样本。

8. 界面用户友好--便于识别、导出数据报告和进行数据管理。

五、细胞计数的总结

尽管许多自动细胞计数仪有类似的功能，但并不相同，并且许多不符合GLP/GMP或21 CRF第11部分的合规要求。目前有两套与细胞计数仪有关的ISO指南：第1部分定义了细胞计数过程、方法选择、样品制备、测量、鉴定、验证、数据分析和报告的术语并提供了一般指南（ISO 20391-1:2018（en）生物技术细胞计数-第1部分）。细胞计数方法通用指南）和提供细胞计数测量过程质量指标评估指南的第2部分（ISO 20391-2-2019生物技术-细胞计数-第2部分：量化计数方法性能的实验设计和统计分析）。

无论何时需要评估细胞计数仪，都必须从样本采集、稀释和染色到数据采集、报告和数据管理的整个工作流程进行审查。与任何实验室流程一样，培训和标准程序是评估的重要组成部分。这么多不同的平台和仪器可供选择和使用，使的细胞计数从未如此容易和可靠，愿BIOFOUNT 给您带来更好的细胞计数体验。